细胞克隆

软琼脂克隆

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状

实验步骤

1. 获取样本，培养细胞，

2. 调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。

3. 制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。

4. 制备上层琼脂,37℃ 密度每皿含200个的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。

5. 当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

细胞自噬

自噬及其生物学功能

细胞自噬(Autophagy)是真核生物中一种由溶酶体介导的高度保守的降解过程。在能量匮乏，活性氧累积等各种胁迫条件下时，细胞通过形成双层膜结构的自噬小体，包裹一部分胞内物质并将其运送到溶酶体进行降解和重新利用，从而维持细胞的存活。根据胞内底物运送到溶酶体的方式不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种主要方式：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy)。通常我们所研究的是巨自噬，简称自噬。

自噬研究常规思路

通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：

1. 证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）

2. 证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）

3. 找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）

4. 在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。

自噬相关研究领域

1.  自噬起始和终止的分子机制

2. 细胞自噬与肿瘤

3. 细胞自噬与免疫

4. 自噬参与炎症信号通路的调节

5. 细胞自噬与神经退行性疾病

6. 激活自噬促进免疫化疗和放疗 

7. 表观遗传学与细胞自噬的关系

8. 药物治疗自噬.